1.5. Ввод пробы в капиллярную колонку
Капиллярная колонка обеспечивает высокоэффективное разделение сложных смесей. Однако малая емкость такой колонки и необходимость работы с весьма малыми количествами пробы делает систему ввода пробы “ахиллесовой пятой” капиллярной хроматографии. Функционирование системы ввода пробы определяет в первую очередь успешную работу всей хроматографической системы, особенно при количественных измерениях.
Были разработаны различные режимы ввода пробы. Это обусловлено, во- -первых, тем, что хроматографирование определяется множеством параметров колонки (диаметр, природа и толщина НФ, емкость). Во-вторых, современная капиллярная хроматография позволяет анализировать соединения различной летучести и термической устойчивости. По указанным причинам универсальной системы ввода пробы не существует и, по-видимому, никогда не будет.
Основным требованием к системе ввода пробы в колонку является полное соответствие состава пробы, введенной в виде узкой зоны, исходному составу анализируемой смеси. Ширина зоны должна быть такой, чтобы ее дисперсия была не существенной по сравнению с дисперсией, обусловленной размыванием пика
Для введения пробы в виде узкой зоны используют два подхода:
В колонку вводят очень маленькие пробы (от 1 до 5 нл). Для этого используются устройства деления потока. Пары пробы, образовавшиеся за счет высокой температуры при вводе пробы, разделяются на два потока с различными объемными скоростями.
Вся проба целиком вводится в колонку, после чего широкая исходная зона сразу же превращается в узкую. Сужение зоны достигается за счет “фокусирования” за счет термического эффекта растворителя или фокусирования посредством НФ.
Ниже будут рассмотрены основные системы ввода пробы, а именно:
Ввод пробы с делителем потока (split injection).
Ввод пробы без делителя потока (splitless injection).
Ввод пробы в колонку (on-column injection).
Прямой ввод пробы (direct injection).
Ввод пробы с программированием температуры испарителя (programmed temperature vaporising injection).
1.5.1. Ввод пробы с делением потока
Этот метод был первым, разработанным в капиллярной хроматографии. Обычное устройство ввода пробы с делением потока представляет собой испаритель. Пробка жидкости, введенная с помощью шприца, мгновенно испаряется, и небольшая часть парообразной пробы поступает в колонку. Основная же часть пробы выводится из системы. Использование делителя потока гарантирует получение узких зон пробы на входе в колонку.
Рис. 5. Схема устройства ввода пробы с делителем потока
На рис. 5 схематически изображен делитель потока. Предварительно нагретый газ-носитель, расход которого устанавливается с помощью регулятора расхода, поступает в устройство ввода пробы. При этом газовый поток разделяется. Часть потока направляется вверх и омывает мембрану. Объемная скорость этого потока регулируется игольчатым вентилем и составляет обычно 3 — 5 мл/мин. Основная часть потока газа-носителя поступает в камеру испарения, представляющую собой вкладыш из стекла или кварца. В камере испарения парообразная проба смешивается с газом-носителем. На входе в колонку этот смешанный поток разделяется и только небольшая часть потока поступает в колонку. Коэффициент деления потока регулируется вентилем тонкой регулировки. Для обычных капиллярных колонок с внутренним диаметром 0,2 — 0,32 мм его значение, как правило, составляет 1:50 — 1:500. Низкие соотношения деления потока могут быть реализованы в сочетании с фокусированием пробы. Для колонок с высокой емкостью, например широких или с толстым слоем НФ, соотношения деления потока обычно более низкие и изменяются в пределах 1:5 — 1:50.
При вводе пробы с делителем потока происходит мгновенное испарение, поэтому трудно избежать дискриминации (искажения) пробы. Дискриминация пробы наиболее выражена, если компоненты пробы присутствуют в разных концентрациях и имеют различную летучесть.
Дискриминация пробы при вводе с делителем потока обусловлена как характеристиками устройства ввода, так и условиями ввода, например работой шприца.
Дискриминация компонентов пробы, обусловленная характеристиками устройства ввода, проявляется как нелинейность деления потока. Линейность делителя потока означает, что соотношение деления потока в точке деления равно предварительно установленному и одинаково для всех компонентов пробы. Если проба содержит компоненты с различной летучестью, полярностью и концентрацией, то линейное деление потока невозможно, даже если ввод пробы в камеру испарения происходит без дискриминации.
Нелинейность деления потока обусловлена рядом причин:
различной скоростью диффузии компонентов пробы;
нестабильностью соотношения деления потока.
Для того чтобы избежать неоднородности смеси в делителе потока обычно повышают температуру ввода пробы, используют оптимальную конфигурацию устройства ввода и стеклянные вкладыши. С целью достижения эффективного теплопереноса и тщательного смешения газа-носителя с испаренной пробой были предложены различные виды стеклянных вкладышей: незаполненные трубки; короткие трубки, заполненные стекловатой и помещаемые в месте деления потока или в области ввода пробы; длинные и узкие трубки со стекловатой; трубки, заполненные носителем или стеклянными шариками и т.д. Использование таких вкладышей часто помогает уменьшить дискриминацию пробы.
Однако большинство проблем, связанных с дискриминацией компонентов пробы, обусловлено эффектами иглы шприца. При прохождении иглы шприца через мембрану начинается испарение летучих компонентов в самой игле, которая нагревается в устройстве ввода пробы. Кроме этого после нажатия поршня шприца растворитель и летучие компоненты смеси испаряются быстрее, чем высококипящие компоненты. Последние частично остаются на стенках иглы шприца. При удалении иглы из устройства ввода вместе с ней удаляются и неиспарившиеся нелетучие компоненты. Это приводит к дискриминации компонентов смеси по их летучести. На рис. 6а приведен пример дискриминации н-алканов при вводе пробы заполненной иглой с делителем потока.
Рис. 6. Дискриминация н-алканов при вводе пробы различными методами. По сравнению с холодным вводом пробы непосредственно в колонку при вводе пробы заполненной горячей иглой наблюдается искажение результатов по содержанию н-алканов, причем оно более выражено по сравнению с вводом незаполненной иглой. Условия эксперимента: смесь н-алканов с одинаковой молярной концентрацией в н-гексане, коэффициент деления потока 1 : 40.
Были изучены многочисленные варианты ввода пробы шприцем. Наиболее простым и часто применяемым является быстрый ввод пробы горячей иглой. Использование этого варианта обеспечивает минимальную дискриминацию пробы, обусловленную шприцем, хотя полностью избежать ее при анализе проб, содержащих компоненты разной летучести, невозможно.
При вводе горячей иглой набирают пробу в шприц таким образом, чтобы между ней и поршнем шприца не было воздушной пробки. Например, в шприц емкостью 10 мкл набирают 2 мкл пробы, достают иглу шприца из жидкости и поднимают поршень до отметки 5 мкл. После введения иглы в зону ввода пробы в течение 3 — 5 с происходит нагрев иглы. Этого времени достаточно, чтобы игла шприца нагрелась до температуры испарителя. Только после этого быстро опускают поршень (быстрый ввод пробы) и через 1 с вынимают иглу из устройства ввода пробы. Эта методика апробирована большим числом исследователей и отмечена хорошая воспроизводимость полученных результатов.
Дискриминация компонентов пробы, обусловленная шприцем и связанная с нагреванием иглы в камере испарителя, может быть сведена к минимуму, если использовать:
ввод пробы охлажденной иглой;
очень быстрый ввод пробы;
ввод пробы при программировании температуры испарителя.
Ввод пробы охлажденной иглой позволяет избежать селективного испарения компонентов пробы из иглы и свести к минимуму влияние условий работы со шприцем на результаты анализа. Это очень важно, поскольку при ручном вводе пробы с делением потока можно получить надежные и воспроизводимые данные как об относительном, так и об абсолютном содержании компонентов
Схема устройства для ввода пробы охлажденной иглой представлена на рис. 7. Игла шприца, находясь во входной трубке, охлаждается холодным воздухом или диоксидом углерода, циркулирующим в узле охлаждения. В горячей камере испарителя находится только кончик иглы длиной 2 — 3 мм.
Рис. 7 Ввод пробы с делением потока охлажденной иглой.
Ввод пробы охлажденной иглой можно автоматизировать. В этом случае стадии ввода идентичны для каждой пробы, что позволяет получить хорощую воспроизводимость результатов, даже, если использовать быстрый ввод пробы.
Цель очень быстрого ввода пробы состоит в том, чтобы все стадии (ввод иглы, впрыскивание пробы и удаление иглы) осуществлялись чрезвычайно быстро — за время недостаточное для нагрева иглы. В этом случае испарение компонентов пробы со стенок иглы практически не происходит, а объем пробы, вводимой в колонку, равен предварительно установленному. Полученные результаты исследований свидетельствуют о том, что заметной дискриминации пробы не происходит, если продолжительность нахождения иглы в устройстве ввода не превышает 0,5 с. Это практически неосуществимо вручную; поэтому обычно используется автоматический ввод пробы.
Ввод пробы при программировании температуры испарителя осуществляют в холодный испаритель, температура которого должна быть ниже температуры кипения всех компонентов пробы. После удаления иглы из испарителя его нагревают с очень высокой скоростью по заданной программе.
При вводе проб с делением потока можно дать следующие рекомендации:
При проведении количественного анализа предпочтение отдается методам стандартной добавки или внутреннего стандарта. Использование метода внешнего стандарта, при котором сравнивают абсолютные площади пиков, допустимо только в сочетании с вводом пробы охлажденной иглой, программированием температуры испарителя или быстрым автоматическим вводом пробы.
Воспроизводимость результатов улучшается, если объем вводимой пробы неизменен. Обычно вводят от 0,5 до 2,0 мкл пробы.
При ручном вводе пробы предпочтение отдается быстрому вводу пробы горячей иглой.
Необходимо правильно подбирать температуру устройства ввода пробы с учетом поставленной задачи. Следует избегать чрезмерно высоких температур испарителя и по возможности легколетучих растворителей.
Если использование вкладышей без насадки неэффективно, можно заменить их вкладышами, неплотно упакованными стеклянными шариками или стекловатой.
Одной из основных проблем, связанных с вводом пробы с делением потока, является работа со шприцем, которую можно решить при помощи автоматических систем ввода пробы (automatic sampling system).
Источник
Капиллярные колонки. Капиллярная хроматография
Колонки —капилляры изготовляют из металла, стекла или полимерного материала, их диаметр составляет обычно десятые доли миллиметра, а длина — от десятков до сотен метров (обычно капилляры наматывают на металлическую катушку). На внутренние стенки капилляра наносят тонкую пленку неподвижной жидкости. Так как капилляры внутри полые, их сопротивление примерно в десять тысяч раз меньше, чем сопротивление насадочной колонки, и чтобы получить достаточную скорость газа-носителя в длинной капиллярной колонке, нужен сравнительно небольшой перепад давления. Кроме того, пленка неподвижной фазы на капиллярах тонкая, что способствует увеличению эффективности колонки. Однако так как пленка тонка, неподвижной фазы в колонке мало: на метр длины капиллярной колонки приходится в десятки раз меньше жидкости, чем на метр насадочной колонки, сечение которой больше, да и жидкость впитывается пористым носителем. Поэтому, чтобы капиллярная колонка не «захлебнулась», величина пробы должна быть во столько же раз меньше. А если проба мала, то нужно, чтобы детектор имел малый внутренний объем и высокую чувствительность. Вот и возникает парадокс. Но, к счастью, именно в эти же годы были предложены пламенно-ионизационный и ионизационный детекторы. Такое гармоничное сочетание элементов аппаратуры сразу обеспечило большой скачок в аналитических возможностях газовой хроматографии. Достаточно сказать, что в 1961 г. Д. Дести и его сотрудники, применив для анализа бензиновой фракции из нефти Понка-Сити стеклянную капиллярную колонку длиной около 300 м и эффективностью миллион теоретических тарелок,
получили на хроматограмме 122 пика за время около 20 часов. Более половины из этих пиков были идентифицированы. А ведь исследователи этой нефти ранее определили лишь 175 углеводородов (из них в бензине — 89) за 33 года работы. Современные методики позволяют получить при анализе бензинов более 200 пиков за время менее двух часов, а если нужно проанализировать смесь нескольких компонентов, то используя специальную аппаратуру для быстрой регистрации, можно получить хроматограмму всего за секунду!
Благодаря высокой эффективности капиллярных колонок, можно провести очень «тонкое» разделение, например разделение, так называемых диастереоизомеров, то есть изомеров, в молекулах которых имеются два или более асимметричных углеродных атомов. Так, на хроматограмме 2,3,4-триметилгексана выявилось два пика: то же самое наблюдалось и для 3,4-диме-тилгептана.
Тем не менее мы должны признать, что в области капиллярной хроматографии сделано далеко не все. К сожалению, не ^всегда и не каждому исследователю удается добиться высокой эффективности колонки. Даже если один и тот же специалист будет последовательно подготавливать несколько одинаковых колонок с одной и той же неподвижной фазой, то они могут оказаться разными по разделяющей способности. Особенно трудно получить идентичные стеклянные капилляры. До настоящего времени ученые не могут прийти к единому мнению о выборе методов обработки внутренних стенок капилляров и нанесения на них нег подвижных жидкостей, особенно полярных. Капиллярная хроматография еще остается искусством даже и в тех случаях, когда для анализа не требуется очень высокой эффективности. Может быть, поэтому многие предпочитают пользоваться более воспроизводимыми насадочными колонками.
Одним из направлений дальнейших исследований в области усовершенствования хроматографических колонок является работа с капиллярами, стенки которых покрыты тончайшим слоем пыли адсорбента или пропитанного жидкостью твердого носителя. Этот тип колонок как бы промежуточный между капиллярными и насадочными, сочетающий достоинства обоих вариантов. Используются и насадочные колонки малого диаметра (1 мм и менее).
Интересно отметить еще одно обстоятельство, связанное с применением капиллярных колонок. В те годы, когда капиллярная хроматография стала ярко демонстрировать свои возможности на примере анализа сложных смесей углеводородов, в качестве неподвижной фазы, как правило, использовали сквалан — изомерный парафиновый углеводород С30Нб2,. Поэтому среди некоторой части исследователей возникло мнение о том, что теперь отпала необходимость в подборе неподвижных фаз: эффективность колонок настолько велика, что можно разделить практически любую смесь на колонке с одной и той же жидкой фазой. Однако по мере того, как хроматографическому анализу стали подвергать все новые и более сложные объекты, убеждались, что это мнение ошибочно и выбор подходящей неподвижной фазы для капиллярной колонки столь же важен, как и для насадочной.
Источник