BioximiaForYou
ОБЕССОЛИВАНИЕ БЕЛКОВОГО РАСТВОРА МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ
Одним из методов разделения веществ является метод диффузионной хроматографии, в частности метод гель-фильтрации. Он применяется для очистки лекарственных препаратов от примесей, для получения чистых белковых растворов на станциях переливания крови, для исследования белковых фракций и др.
Разделение веществ этим методом основано на различии в размерах молекул. Крупные молекулы не проникают в поры гранул геля и выходят из колонки в первую очередь, в то время как небольшие молекулы попадают через поры в гранулы, вследствие этого задерживаются на колонке и движутся с меньшей скоростью. Метод гель-фильтрации часто называют разделением веществ по принципу молекулярного сита.
Для обессоливания белкового раствора методом гель-фильтрации используют молекулярные сита – инертные гидратированные полисахаридные материалы, представляющие собой простые гранулы. Их получают из нитевидных молекул полисахарида декстрана, которые «сшиты» через определённые промежутки поперечными связями и свёрнуты в гранулы (коммерческое название «сефадекс»). Существует несколько типов сефадекса, различающихся как размером пор, так и величиной гранул. Это позволяет применять их для разделения веществ с разными размерами молекул. Благодаря высокому содержанию гидроксильных групп гранулы сефадекса легко набухают, образуя гель. Чем выше способность геля к набуханию, тем больше номер сефадекса. В зависимости от размеров пор в гранулах выпускают ряд марок сефадексов: G -200, G -100, G -75 и др. В качестве молекулярных сит используют также агар и полимеризованные акриламидные гели (акрилекс).
Принцип метода: Молекулы разных размеров различают по способности проходить через поры внутрь гранул геля. Небольшие молекулы, эффективно проникающие внутрь гранул сквозь поры, проходят через колонку, заполненную гелем, медленнее, чем вещества, молекулы которых слишком велики. Об эффективности разделения смеси судят по составу вытекающего из колонки раствора (элюата).
Реактивы, оборудование, исследуемый материал:
1. раствор яичного белка
2. гель сефадекс G -75
5. пробирки и штативы
6. фракционирующий раствор (смесь бихромата калия с раствором яичного белка: 1% раствор яичного альбумина в 0,5%-ном растворе хромата калия)
7. дистиллированная вода
8. биуретовый реактив
1. Приготовление геля: 4 г сефадекса G -75 заливают (суспендируют) в 200 мл дистиллированной воды в химическом стакане.
2. Подготовка колонки: Колонку закрепляют строго вертикально на штативе. Под колонку ставят стакан. Заполняют колонку гидратированным сефадексом (гелем) на высоту около 20 см. Заполнять колонку следует через воронку из маленького стаканчика, регулируя скорость элюирования, открыв нижний зажим колонки. Вода должна беспрепятственно проходить через колонку, а гель должен задерживаться в колонке. Гель надо наливать медленно и беспрерывно, чтобы он распределялся в колонке равномерно (не должно быть слоёв), строго горизонтально, без пузырьков воздуха.
3. После заполнения колонки гелем кран необходимо закрыть, а над гелем должен находиться слой воды (около1см.)
4. Взвесить 5мг K 2 Cr 2 O 7 (бихромат калия)
5. Для приготовления фракционирующего раствора надо добавить бихромат калия в 1мл 1% раствора яичного белка (бихромат нужен для подкрашивания раствора белка, чтобы наблюдать за процессом обессоливания).
6. Подготовить штатив с пробирками для сбора фракций (15 пробирок)
7. Открыть кран на колонке. Когда над слоем геля останется 1-2мм дистиллированной воды, кран закрыть и добавить в колонку 1мл фракционирующего раствора.
8. Кран открыть до полного впитывания фракционирующего раствора в гель и снова закрыть кран.
9. В колонку внести 2мл дистиллированной воды при закрытом кране. Вносит надо очень осторожно, чтобы не взмутить гель.
10. Подключить капельницу с дистиллированной водой, предназначенную для элюирования (вымывания) разделяемых веществ. Открыть зажим на капельнице и внизу колонки (вода из капельницы должна равномерно малыми порциями поступать в колонку и вымывать смесь; во время разделения смеси надо следить, чтобы в колонке был ток жидкости, т.е. кран должен быть открыт.)
11. В каждую чистую пробирку собирают по 20 капель элюата.
По мере прохождения через колонку раствора воды, фракционирующая смесь разделяется на составные компоненты. Сначала элюируются молекулы белка, т. к. их относительная молекулярная масса больше, они не могут проникнуть в поры гранул геля, а проходят между гранулами. Молекулы бихромата калия с меньшей молекулярной массой сначала проникают в поры гранул и лишь затем элюируются.
12. Во все пробирки с фракциями добавьте по 1мл биуретового реактива. В пробирках с белком наблюдается сине-фиолетовое окрашивание. Соль обнаруживается по жёлтой окраске фракций
13. Зарисуйте все пробирки в тетради, отметьте, с какой пробирки появилась фракция белка, с какой соль.
Источник
Колонка для гель фильтрации
 [ Ответ на тему ] |
 |
| Автор | Тема: Выбор колонки для гель-фильтрации | |
| Entomo Пользователь Ранг: 9
|  16.09.2011 // 22:13:26 Уважаемые форумчане, История такая. Появилась возможность купить колонку для гель-фильтрации. Но с выбором ее самим не определиться. Изначально планировали делить пептидные соединения по какому-либо признаку, отличному от степени гидрофобности, как мы это делаем на ВЭЖХ колонке С-18. Решили выбрать в качестве этого признака размер пептида. Оптимален ли вообще выбор гель-фильтрации в этом случае? Может, появились какие-то более чувствительные методы фракционирования по размеру частиц? Сразу же скажу, что в ряде случаев работаем с неизвестными пептидами, то есть не знаем их свойств, кроме относительной молекулярной массы (определяем ультрафильтрацией) и степени гидрофобности (определяем твердофазной экстракцией). Местонахождение в какой-либо из фракций определяем по реакции на нее клеточной культуры и бактерий в антимикробном тесте. Если это существенное дополнение, то хроматограф наш — марки «SHIMADZU») Спасибо. | |
| ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |  | |
| Farma Пользователь Ранг: 382 | 19.09.2011 // 15:42:59 История такая. Появилась возможность купить колонку для гель-фильтрации. Но с выбором ее самим не определиться. Изначально планировали делить пептидные соединения по какому-либо признаку, отличному от степени гидрофобности, как мы это делаем на ВЭЖХ колонке С-18. Решили выбрать в качестве этого признака размер пептида. Оптимален ли вообще выбор гель-фильтрации в этом случае? Может, появились какие-то более чувствительные методы фракционирования по размеру частиц? Сразу же скажу, что в ряде случаев работаем с неизвестными пептидами, то есть не знаем их свойств, кроме относительной молекулярной массы (определяем ультрафильтрацией) и степени гидрофобности (определяем твердофазной экстракцией). Местонахождение в какой-либо из фракций определяем по реакции на нее клеточной культуры и бактерий в антимикробном тесте. Если это существенное дополнение, то хроматограф наш — марки «SHIMADZU») ИМХО не нужна Вам гель-фильтрация, а нужна нормальная С18 колонка, возможно широкопористая. Для гельфильтрации значение будет иметь не только размер молекулы, но и разница в размерах отдельных компонентов смеси. Если она несущественная, то намучаетесь. Если не секрет, чем ОФ не устраивает? | |
| Garry VIP Member Ранг: 1075 | 19.09.2011 // 16:09:31 Либо ионообменная колонка. Можно воспользоваться анионообменником типа АХ. Либо С 18 с ПФ имеющей в составе ТФУ 0,1 %, потому как нормальная гель-фильтрация начинается от 1000 кДа, а такие массы как 10 кДа — нонсенс для ГПХ, равзве что капиллярный | |
| Garry VIP Member Ранг: 1075 | 19.09.2011 // 16:09:58 Либо ионообменная колонка. Можно воспользоваться анионообменником типа АХ. Либо С 18 с ПФ имеющей в составе ТФУ 0,1 %, потому как нормальная гель-фильтрация начинается от 1000 кДа, а такие массы как 10 кДа — нонсенс для ГПХ, равзве что капиллярный электрофорез. | |
| Entomo Пользователь Ранг: 9 | 19.09.2011 // 18:04:31 Нет-нет, я ни в коем случае не отрекаюсь от ОФ. Колонка С18 с 0,1% ТФУ — это наш основной помощник в разделении образцов. Ну, та же ионная пара по сути получается, ведь так? Просто, помимо гидрофобности хочется еще по какому-нибудь признаку поделить. Выбрали размер. Хотелось бы фракции, полученные ОФ ВЭЖХ, прогнать через гельфильтрационную колонку. По размеру, начиная от 100 кДа? Наверное, Вы путаете гельфильтрацию с гель-проникающей хроматографией (ну, судя по той литературе, которую я успел на выходных проштудировать). Так что жду комментариев. Всем спасибо за советы. | |
| AA_Alex Пользователь Ранг: 342 | 19.09.2011 // 18:31:16 По размеру, начиная от 100 кДа? Наверное, Вы путаете гельфильтрацию с гель-проникающей хроматографией (ну, судя по той литературе, которую я успел на выходных проштудировать). Так что жду комментариев. Всем спасибо за советы. Слышал хорошие отзывы о Вотерсовских колонках для ГПХ. У них есть и для «мелких» молекул (100-5КД и 100-10КД): Сам на таких не работал. А Вы пептиды, случайно, не из гемолимфы насекомых выделяете (судя по нику Entomo)? | |
| Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
| |
| абр Пользователь Ранг: 880 | 19.09.2011 // 19:33:17
А чем принципиальная разница? | |
| Farma Пользователь Ранг: 382 | 19.09.2011 // 19:47:58
Просто, помимо гидрофобности хочется еще по какому-нибудь признаку поделить. Выбрали размер. Хотелось бы фракции, полученные ОФ ВЭЖХ, прогнать через гельфильтрационную колонку. Так что жду комментариев. Так для комментариев маловато информации. Биосеп теоретически подойдёт (та, у которой диапазон эксклюзии 1-300 кДа), но повторю вопрос, на который Вы не ответили: насколько различаются размеры молекул пептидов в смеси? Если они все по 1 кДа, то не получится. В качестве других механизмов для разделения Вам уже подсказали электростатическое взаимодействие. Да можно что угодно, хоть HILIC использовать. ИМХО шансов больше, чем при GFC без четкого понимания о составе смеси. | |
| Entomo Пользователь Ранг: 9 | 20.09.2011 // 12:20:21 Редактировано 1 раз(а) 2 AA_Alex: За ссылку спасибо, будем смотреть-сравнивать. Да, мы выделяем пептиды из гемолимфы насекомых и из культуральной жидкости тканей насекомых. Из лизата клеток — в ближайших планах. 2 абр: Насколько я понял, по принципу разделения гель-фильтрационная и гель-проникающая хроматография не различаются. Сито — и есть сито. Различаются они только по целям разделения. Гель-проникающая хроматография служит для очистки крупных молекул от мелкого мусора. Поэтому поры в ГП колонках имеют сравнительно большой размер и для разделения мелочи действительно не подходят. Гель-фильтрация же используется для разделения всяких-разных молекул: в зависимости от выбранной ГФ колонки, мы можем разделить и сравнительно мелкие молекулы, все завист от размера пор — в ГФ колонке они могут быть очень маленькими. То есть у ГФ задачи шире просто. 2 Farma: Сразу отмечу, что в большинстве случаев мы не знаем размера интересующего нас пептида, когда выделяем его из смеси. Его наличие в какой-либо из фракций мы определеяем по реакции культуры клеток на добавление этой фракции. При этом, разница в молекулярных массах белков гемолимфы могут отличаться В СОТНИ РАЗ. Так что вроде как, этот, относительно грубый, метод годится для наших экспериментальных задач. Одно из направлений нашей работы — это выделение антибиотиков из гемолимфы насекомых. Тут, возможно, катионообменная хромаография нам и подошла бы, поскольку эти антибиотики являются катионными пептидами. С катионной хроматографией я пока не разбирался, но ведь, насколько мне известно, уравновешивание неполярной колонки ТФУ для последующего смыва градиентом ацетонитрила является разновидностью динамической модификации сорбента. И по сути, превращает неполярный сорбент в полярный. То есть, электростатику получаем. Или я не прав? По поводу HILIC ничего сказать не могу. Там же ведь тот же принцип, что и в ОФ, только не растворителем вымываем из воды, а водой из растворителя. Тоже по степени гидрофобности делит, получается. Или я ошибаюсь и оба эти метода (катионообменная хроматография и нормально-фазовая хроматография) помогут в дальнейшем разделении фракций, полученных ОФ ВЭЖХ? Поскольку основная наша задача сейчас — найти метод, ДОПОЛНЯЮЩИЙ ОФ. Всем спасибо за ответы. | |
| AA_Alex Пользователь Ранг: 342 | 20.09.2011 // 14:43:04 Редактировано 2 раз(а)
Тогда подумайте — может Вам проще и дешевле будет что-нибудь типа Миллипоровских Амиконов — есть на 3 и 10 КД, у других производителей видел на 5 КД. При этом у Вас образец не будет разбавляться как при фракционировании на колонке. | |
| Farma Пользователь Ранг: 382 | 20.09.2011 // 14:55:30
Для этих целей я бы рекомендовал ТФЭ с RAM сорбентом. Мы такой штукой неоднократно баловались и ИМХО в случаях когда нужно отделиться от высокомолекулярщины равных этому методу нет. Тем более, что есть in-line версия (встраиваемая в ВЭЖХ систему). Еще как вариант можно использовать ионообменную или сайзэксклюзионную хроматографию среднего или низкого давления. Вариантов масса, в том числе есть небольшие картриджи, встраиваемые в ВЭЖХ систему. Для количественного выделения очень хорошая вещь. Оба метода по цене вопроса будут ЗНАЧИТЕЛЬНО дешевле Биосепа. |