1.4 Основные типы хроматографических систем в ВЭЖХ
запись создана: 06.11.2010 / последнее обновление: 06.11.2010
По типу используемых сорбентов, механизмам сорбции, протекающим на границе раздела фаз и составу элюента, жидкостную хроматографию можно разделить на несколько вариантов ее реализации:
1. Нормально-фазовая,
2. Обращенно-фазовая,
3. Ионо-обменная,
4. Эксклюзионная (ситовая, гель-проникающая).
Данный перечень включает только наиболее распространенные и часто встречающиеся варианты ЖХ, хотя наибольшее количество аналитических задач в хроматографии (до 98 %) решается с использованием первых трех вариантов.
Для решения специальных задач разделения существуют и специфические виды ЖХ, например, лигандообменная и аффинная, которые трудно отнести к какому либо из перечисленных. Однако, их использование весьма ограничено и подробное рассмотрение в рамках данного раздела, видимо — нецелесообразно.
Кроме приведенной классификации, существует разделение вариантов ЖХ на основе реализуемых в хроматографической системе механизмов сорбции. Так, например, различают хроматографию: адсорбционную, распределительную, ион-парную, гидрофобную, гидрофильную и т.д. Тем не менее, учитывая, что среди хроматографистов до сих пор нет единого мнения о механизмах протекания взаимодействия разделяемых веществ с сорбентом даже в относительно простых сорбционных системах, такая классификация достаточно условна. Более того, следует признать, что сорбционные взаимодействия крайне редко протекают по какому-то одному механизму. Чаще проявляется одновременно несколько механизмов сорбции. Следует также учесть, что в одних и тех же условиях один из компонентов пробы может удерживаться на сорбенте по одному механизму, а другой – по совершенно иному.
Нормально-фазовая (НФ) хроматография – исторически первый вариант ЖХ. Основной его отличительной особенностью является более высокая полярность поверхности сорбента по сравнению с элюентом.
В качестве сорбента используется либо силикагель, либо сорбенты на его основе с полярными группами (амин-, нитрил-, диол- и т.п.), химически пришитыми на поверхность. Гораздо реже используют другие неорганические вещества с полярной поверхностью: оксид алюминия, оксид циркония, силикат магния и т.п.
Элюентом служат смеси органических растворителей. Элюотропный ряд с увеличением силы элюента строится от наименее полярных к более полярным веществам:
Алканы – пентан, гексан, гептан, изооктан;
ароматические углеводороды — бензол, толуол, ксилол;
галогеналканы – хлороформ, дихлорметан, дихлорэтан;
эфиры – диэтиловый, диизопропиловый, тетрагидрофуран, диоксан, этилацетат, бутилацетат;
кетоны – ацетон, метилэтилкетон, циклопентанон;
нитрилы и амиды – ацетонитрил, диметилформамид
спирты – изопропанол, этанол, метанол;
вода, низкомолекулярные карбоновые кислоты.
Двухкомпонентные элюенты без модификаторов, содержащие значительные количества воды, в нормально-фазовой хроматографии практически не используются. Однако, при введении в водосодержащий элюент специальных модифицирующих добавок, например – солей, на силикагеле, например, можно реализовать интересные режимы разделения, и такие хроматографические системы находят в настоящее время все большее применение.
Обращенно-фазовая (ОФ) хроматография – вариант, когда сорбент является неполярным, а элюент – полярным. То есть, по отношению к нормально-фазному режиму – все наоборот. Это и дало основание так назвать этот вид ЖХ, который является самым распространенным из всех существующих.
В качестве сорбента для ОФХ чаще всего используют силикагель, с химически пришитыми к его поверхность алкильными группами разной длины (октадецил, гексадецил, октил, бутил, метил) и другими неполярными молекулами (фенил). В последнее время все чаще применяются сорбенты на основе двуокиси циркония, углерода и органических полимеров, например, сверхсшитого полистирола, сополимера стирола с дивинилбензолом и т.п. В ОФ режиме могут использоваться также и сорбенты, предназначенные для НФ-хроматографии (амино- и нитрилсиликагель), в этом случае их свойства в плане удерживания (коэффициента емкости) близки к этил- или пропилсиликагелю, но селективность разделения может существенно отличаться.
Элюентом в этом режиме являются смеси воды (или водных растворов солей) с водосовместимыми органическими растворителями. Сила элюента увеличивается от самого полярного растворителя (вода), к самому неполярному.
Вода;
Метанол;
Ацетонитрил;
Этанол;
Тетрагидрофуран;
Изопропанол, пропанол;
Диоксан, этилацетат, эфир.
Элюенты без воды используются крайне редко, но бывают случаи применения в обращенно-фазных хроматографических системах (особенно — на полимерных сорбентах) смесей метанол-диоксан, или даже — изопропанол-хлороформ, что связано с необходимостью существенно изменить селективность разделения или добиться уменьшения удерживания таких малополярных веществ, как, например, углеводороды или жиры (триглицериды жирных кислот).
Вода без органических растворителей в качестве элюента для ОФ режима — обычно также не применяется. Лишь некоторые из обращенно-фазовых сорбентов, принципиально могут работать без ущерба для себя с таким элюентом. Большинство же ОФ сорбентов в воде, мало того, что плохо смачиваются, но и подвержены коллапсу — разрушению структуры поверхности, когда алкильные цепочки схлопываются и поверхность сорбента теряет свои первоначальные сорбционные свойства. Исходя из этого, нежелательна работа на таких сорбентах с элюентом на основе воды, содержащем менее 5 — 10% органического растворителя.
Ионо-обменная хроматография – предназначена, в основном, для разделения неорганических ионов и ионогенных органических веществ.
В качестве сорбентов используются ионообменные смолы или сорбенты на основе силикагеля с химически модифицированной поверхностью, на которой сформированы функциональные группы, способные к ионному обмену.
Элюентом в этом варианте хроматографии выступают водные растворы солей или буферных систем на их основе. Увеличение элюирующей силы обеспечивается изменением рН, увеличением ионной силы растворов и добавкой органических растворителей. Следует отметить, что большинство сорбентов на основе силикагеля нестойки в щелочной среде, а потому их использование возможно лишь в интервале рН от 2 до 8 — 10 (иногда – меньше). И, если условия хроматографии изначально требуют использования более высоких рН элюента, лучше сразу выбрать сорбент на основе полимера или другого гидролитически стойкого материала.
Эксклюзионная хроматография – пожалуй, наиболее сильно отличается от других видов ЖХ как по принципу разделения, так и по методическим особенностям. Предназначена она преимущественно для разделения крупных молекул и частиц, в частности – полимеров, в соответствии с их размером. При этом сорбции веществ как таковой не происходит, а разделение обеспечивается за счет способности более мелких молекул в процессе продвижения с потоком элюента по колонке заходить в мелкие поры сорбента, увеличивая тем самым длину своего пути в колонке. Крупные молекулы из-за своих размеров попасть в мелкие поры не могут и вынуждены совершать свой путь по колонке с «заходом» в гораздо более широкие поры, а то и вообще без проникновения в поры сорбента. Благодаря этому длина пути в колонке крупных молекул (частиц) оказывается наименьшей, и они выходят раньше более мелких, а те, в свою очередь, выходят раньше еще более мелких, разделяясь при этом исключительно по размерам.
Если есть возможность и нет необходимости разделять вещества именно по размерам их молекул, то эксклюзионной хроматографии стоит предпочесть любой другой вид ЖХ, поскольку эксклюзионная хроматография наиболее бедна в плане наличия степеней свободы для воздействия на хроматографический процесс.
В качестве сорбентов используются различные широкопористые полимерные и минеральные субстраты, в частности — акриловые и полиуглеводные полимеры, а также особые силикагели – широкопористые стекла. Ассортимент сорбентов для эксклюзионной хроматографии очень широк, и выбор конкретного сорбента полностью определяется химической структурой и диапазоном молекулярных масс, предполагаемых к разделению компонентов пробы.
Элюентом может служить любой растворитель, который хорошо растворял бы образец и обеспечивал на данном сорбенте отсутствие сорбции («отрицательную» сорбцию) компонентов пробы. Это как раз тот вариант, когда элюент может быть однокомпонентным. На силикагелевых сорбентах часто используют тетрагидрофуран, ацетон, дихлорэтан. На полимерных – спирты, воду и их смеси.
В общем случае, для эксклюзионной хроматографии элюирующая сила используемого растворителя, как параметр — теряет свой первоначальный смысл. Существенно изменить делящие свойства хроматографической системы в этом режиме может только замена сорбента.
Источник
Обращенно-фазовая распределительная хроматография
Вариант распределительной хроматографии, в котором используют сорбенты с привитыми неполярными, как правило, длинными алкильными или алкилсилильными группами (а также фенильными, аминопропильными и др.) и полярный растворитель (например, водно-метанольные, водно-ацетонитрильные смеси) получил название обращенно-фазовой ВЭЖХ. Этот термин, указывает на перемену полярности неподвижной и подвижной фаз на противоположные в данном варианте ВЭЖХ.
В качестве разбавителя в ОФХ используют бидистиллированную и (или) деионизированную воду, а в качестве модификаторов преимущественно метанол и ацетонитрил, реже тетрагидрофуран. Спирты, кроме метанола, используют редко, так как их вязкость и вязкость водно-спиртовых элюентов слишком большие, что приводит к высокому рабочему давлению, ухудшает эффективность разделения вследствие затрудненной диффузии в подвижной фазе. Тетрагидрофуран нестабилен при хранении (легко окисляется, накапливая гидропероксиды, которые уменьшают диапазон пропускания УФ света, способны окислять привитую фазу, сорбаты и взрывоопасны). Ацетонитрил имеет ряд преимуществ перед метанолом. При хорошей очистке он лучше пропускает в ближнем ультрафиолетовом диапазоне (ниже 210 нм) и позволяет работать в смеси вода-ацетонитрил при 200 и даже 190 нм. Он обычно обладает лучшими растворяющими свойствами для органических проб, чем метанол, водно-ацетонитрильные смеси менее вязки, чем смеси вода — метанол. Наконец, не малую роль играет и то обстоятельство, что метанол относится к группе особо опасных ядов, находящихся на строгом контроле и учете, тогда как ацетонитрил к этой группе не относится.
Хроматограмма экстракта листьев стевии. Колонка — Luna NH2 250×4.6 мм. Подвижная фаза: деионизированная вода (рН 5,5) (А) — ацетонитрил (В). Программа градиента: 87-82,5% В за 12 мин, 82,5-79% В за 8 мин, 5% В — 5 мин, 5-87% В за 1 мин, 87%В — 3 мин. Объёмная скорость: 1.5 мл/мин. Детектирование: УФ 210 нм.
Существует принципиальное различие между процессами сорбции на полярных поверхностях из относительно неполярных растворителей (НФХ) и сорбции из воды либо сильнополярных растворителей на неполярных поверхностях (ОФХ). В первом случае между молекулами сорбатов и неподвижных фаз образуются ассоциаты за счет кулоновских взаимодействий или водородных связей. Во втором случае причиной ассоциации на поверхности являются так называемые сольвофобные взаимодействия в подвижной фазе. Для полярных ПФ, в особенности содержащих воду, характерно сильное кулоновское взаимодействие и образование водородных связей между молекулами растворителей. Все молекулы в таких растворителях связаны довольно прочно межмолекулярными силами. Для того чтобы поместить в эту среду молекулу сорбата, необходимо образование «полости» между молекулами растворителя. Энергетические затраты на образование такой «полости» лишь частично покрываются за счет взаимодействия полярных групп в молекуле сорбата с полярными молекулами растворителя. В аналогичном положении по отношению к растворителю находятся и неполярные молекулы неподвижной фазы. С энергетической точки зрения более выгодно такое положение, когда поверхность раздела между полярной средой (растворителем) и неполярными фрагментами неподвижной фазы и молекул сорбата минимальна. Уменьшение этой поверхности и достигается при сорбции.
Таким образом, причиной сорбции в ОФХ являются диполь-дипольные взаимодействия полярных молекул ПФ, их сильное притяжение одна к другой. Это приводит к сольвофобному вытеснению менее полярных молекул из полярной среды элюента к неполярной поверхности сорбента. Роль поверхности неподвижной фазы в ОФХ — выступать акцептором молекул сорбата, ориентированных к ней гидрофобным фрагментом и удерживать его слабыми дисперсионными силами. Наиболее существенными факторами удерживания сорбатов являются размеры их молекул, дипольный момент, поляризуемость и способность к гидрофобным взаимодействиям неполярной части молекулы, обеспечивающая уменьшение площади неполярной поверхности при сорбции.
Метод ОФХ в настоящее время является доминирующим в ВЭЖХ. Среди рутинных методик анализа 70-80% основаны на том или ином варианте ОФХ. Причины широкого внедрения метода в том, что для него налажено производство сорбентов, имеющих привитые алкилсилильные группы разной длины (от С2, до С18 с прямой алкильной цепью, фенильной и дифенильной группами), а растворители, используемые для этого метода (ацетонитрил, метанол, ТГФ, вода), позволяют работать с оптическими детекторами в УФ и видимом диапазоне спектра, так как они прозрачны в УФ свете.
Пределы прозрачности ПФ в зависимости от состава и химической чистоты модификатора лежат в области 190-220 нм. Наиболее доступный УФ детектор в условиях ОФХ приближается по возможностям к неселективному универсальному детектору, делая возможным анализ углеводов, липидов, сложных эфиров, спиртов и олефинов.
Хроматограмма антоцианидинов в условиях градиентной ОФХ: колонка Zorbax XDB-C18, 250×4.6 мм 5 мкм, 30°С, 520 нм, ПФ вода — метанол — ацетонитрил (90/6/4)→(0/85/15), расход 1 мл/мин. В воду добавляли 0.05% трифторуксусной кислоты.
Растворители, используемые в ОФХ, относительно легко растворяют многие практически важные органические и природные вещества, находящиеся в организме человека, биологических объектах, в пище, лекарственных препаратах, и т.д.
Сорбенты в обращенно-фазовой ВЭЖХ быстро приходят в равновесие с новыми растворителями и при изменении состава растворителя, что позволяет без проблем переходить от одной методики к другой с использованием одной и той же колонки, а также широко применять градиентное элюирование с быстрым восстановлением равновесия сорбента с исходным растворителем. Сорбенты дают возможность использовать растворители в широком диапазоне свойств, а также добавки разных типов (соли, кислоты и основания, ион-парные реагенты, органические модификаторы).
Следует иметь в виду, что характеристики удерживания и селективности для обращенно-фазовых сорбентов меняются не только при переходе от сорбента одного производителя к сорбенту другого (например, от силасорба С18 к партисилу ОДС), формально имеющих одинаковую привитую фазу. Эти характеристики меняются более или менее значительно даже при переходе от одной партии сорбента к другой партии того же производителя. Исходные силикагели, используемые разными фирмами, заметно различаются по поверхности, объему и размеру пор. Для прививки фаз с общим названием С18 или ОДС применяют разные и по структуре, и по химической однородности реагенты. Например, для получения привитой фазы ОДС (октадецилсилан, ODS) используют октаде-цилтрихлорсилан, метилоктадецилдихлорсилан и диметилоктадецилхлорсилан. Если используют ди- или трифункциональные силаны, то в зависимости от степени безводности растворителей и силикагеля, на поверхности может получиться мономерная пленка фазы (монослой) или же полимерная (чем больше воды, тем выше степень полимеризации). Свойства мономерной и полимерных пленок с разной степенью полимеризации изрядно различаются. Наконец, силанольные группы, находящиеся на поверхности исходного силикагеля, к которому прививается фаза, не могут из-за пространственных затруднений быть полностью замещены. Например, диметилоктадецилсилильными группами в самых жестких условиях прививки удается заместить примерно половину силанольных групп. Остающиеся силанольные группы не удается полностью устранить даже в процессе так называемого «эндкеппинга» (окончательного покрытия поверхности силикагеля), когда используют молекулы более активного низкомолекулярного силана (обычно триметилхлорсилана). Силанольные группы на поверхности такого привитого сорбента могут взаимодействовать с некоторыми компонентами пробы и в ряде случаев являются фактором удерживания, конкурирующим с сольвофобными процессами.
Наряду с неполярными привитыми фазами, выпускаемыми специально для ОФХ, в обращенно-фазовом варианте часто используют нитрильную и аминную привитые фазы, а иногда и диольную. В этом случае они разделяют вещества в основном по сольвофобному механизму, как имеющие короткий (C3) привитой алкилcилан, а полярные группы или не участвуют в разделении, или играют второстепенную роль, несколько меняя селективность для ряда веществ определенной химической структуры.
Одна из важных причин, способствовавших быстрому росту применения обращенно-фазовых сорбентов в ВЭЖХ, это их способность четко разделять серии гомологов в порядке возрастания их молекулярной массы. При этом гомологи могут, в отличие от разделяемых методами ЖАХ или НФХ, не иметь функциональных групп, т.е., обращенно-фазовый сорбент может разделять гомологи алканов, аренов, фенолов и т.д. Это вовлекает в область анализа методом ВЭЖХ такие важные объекты, как компоненты нефти и продукты нефтехимии. Если нужно разделить вещества неполярные или малополярные, практически любой обращенно-фазовый сорбент может при относительно простом подборе растворителя обеспечить почти идентичное разделение.
Источник